Description

마이코플라스마(Mycoplasma) 부정시험의 직접법을 대체할 수 있는 신속하고 간편한 Real-time PCR 검출 키트

• • 국내, 미국 및 유럽 약전의 핵산 증폭법 기반의 Mycoplasm 부정시험 항목을 만족할 수 있는 성능을 입증
• • 세포치료제 등 재생 의약 분야의 의약품 제조 전/중/후 공정검사 및 배양 세포주의 오염 모니터링에 적합
• • 직접법을 대체 할 수 있는 높은 민감도 (10 cfu/ml 수준)
• • 근연관계에 있는 다른 미생물을 검출하지 않는 높은 특이도 (국내 부정시험 밸리데이션 관련 균주 3종 포함)
• • 폐관확인이 가능하므로 결과물에 의한 오염을 방지할 수 있으며 사용 최대 3시간 이내에 결과를 확인할 수 있는 Real-time PCR 법 사용
• • 취급이 간편하기 때문에 실험자 간의 편차 혹은 오염의 최소화

Mycoplasma는 세포배양에서 흔하게 관찰되는 심각한 오염원입니다. 알려진 바로는 약 30~87%의 세포 배양이 Mycoplasma에 감염되어 있습니다. 이는 (사람을 통한) 실험 과정 중에서 일어날 수도 있으며, 때로는 동물 유래의 제품 (혈청 등)을 통해서도 이루어질 수 있습니다. Mycoplasma는 다른 일반 세균과 달리 세포벽이 없기 때문에 Filter의 pore를 통과할 수 있고, 세포벽 합성 저해 기작을 갖는 항생제의 영향을 받지 않고 생육할 수 있습니다. 또한, 현미경 상으로 잘 보이지 않으며, 오염시킨 세포의 생육에 영향을 미칠 뿐 죽이지 않는 것이 대부분이므로 Mycoplasma에 의한 오염을 인지하지 못한 채 배양이 지속적으로 이루어지게 됩니다.

e-Myco™ VALiD-Q Mycoplasma qPCR Detection Kit는 PCR 법을 통해 Mycoplasma의 특정 유전자를 증폭시킴과 동시에 증폭 산물 특이적인 프루브의 형광을 이용하여 실시간으로 Mycoplasma를 검출하는 제품입니다. 현재 세포치료제의 품질관리를 위해 사용하는 Mycoplasma 시험법(배양법)은 시험 기간이 매우 길고, 주로 대량 생산되는 백신 및 단일클론항체 의약품 등의 생산에 이용되는 세포 기질 시험을 위해 만들어졌기 때문에 매우 짧은 유효기간을 갖는 세포치료제는 여러 제한(검체량, 검체수 및 배지량)으로 인해 최종 품질관리 시(출하시험) 기존 시험방법을 그대로 적용하기가 현실적으로 어려운 실정입니다.

본 제품은 기존 자사 제품인 e-Myco™ VALiD Mycoplasma PCR Detection Kit의 후속 제품인 e-Myco™ VALiD-Q Mycoplasma qPCR Detection Kit으로써 Real-time PCR 법을 이용하여 다양한 종류의 Mycoplasma를 짧은 시간에 높은 민감도를 가지고 특이적으로 검출할 수 있는 제품입니다. 본 제품은 Mycoplasma의 16S Ribosomal RNA 영역으로 대상으로 하여 높은 특이도 및 민감도로서 Mycoplasma 타겟 유전자를 증폭하며 타겟 유전자 증폭 산물 내부의 특정 핵산 서열에 대한 상보적인 서열을 가진 Probe 는 5‘말단에 형광 발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되며 3’ 말단에는 소광제(quencher)가 표지되어 타겟 유전자의 증폭 과정 중 DNA polymerase에 의하여 분해되어 소광제와 떨어진 형광 발색제가 발산하는 signal의 세기를 측정함으로써 Mycoplasma 정성분석을 수행할 수 있게 됩니다. 본 제품은 Primer와 더불어 Probe 의 특이도에 영향을 받으므로 기존 PCR 법 보다 높은 특이도를 가지고 있다. 또한, 내부 대조구 (Internal positive control)를 포함하고 있어 Target signal과 함께 IPC signal이 검출되도록 설계되어 분석의 신뢰도를 확보할 수 있습니다.

 

 

Application

• 01세포 기반 의약품 생산 전/중/후공정의 Mycoplasma 오염 모니터링
• 02세포주의 오염 관리
• 03검체 및 세포주의 Mycoplasma 검출 TA cloning

Kit Contents

Contents	Storage	Amount
2X qPCR Master Mix Solution	-25 ~ -15℃	280 μl x 2 tubes (10 μl / test × 50 tests)
Mycoplasma Detection Solution	-25 ~ -15℃	140 μl x 2 tubes
Positive Control (External PC)	-25 ~ -15℃	50 μl x 3 tubes
DNase/RNase Free Water	-	1 ml
Manual	-	1 ea

Technical Data

Fig. Specificity of e-Myco™ VALiD-Q Mycoplasma qPCR Detection Kit

A) Mycoplasma hyorhinis(Positive Control), B) Nuclease free water(Negative Control), C) Clostridium perfringens, D) Streptococcus mutans,
E) Lactobacillus plantarum, F) Mobiluncus mulieris, G) Gardnerella vaginalis, H) Chlamydia trachomatis

Fig. Analytical Sensitivity of e-Myco™ VALiD-Q Mycoplasma qPCR Detection Kit

A) Mycoplasma arginini, B) Mycoplasma fermentans, C) Mycoplasma hyorhinis, D) Mycoplasma orale, E) Mycoplasma pneumoniae, F) Acholeplasma laidlawii.

e-Myco™ VALiD-Q Mycoplasma qPCR Detection Kit는 가이드라인에서 제시하는 6종의 Mycoplasma에 대하여 모두 검출 가능함을 확인하였으며, 각각의 균주에 대하여 분석적인 민감도 분석결과 검출한계 10 cfu/ml 이상임을 확인하였습니다. 이를 통하여 본 제품은 핵산 증폭법을 이용한 Mycoplasma 부정시험법 가이드라인에 준하는 성능을 갖추고 있어 직접법을 대체할 수준임을 확인할 수 있었습니다.

 

직접법과 본 제품의 민감도를 동시에 비교하는 시험을 실시하였습니다. 초기 미지 농도의 배양액을 사용하여 직접배양을 통해 Mycoplasma를 검출하였을 때 최대 1/10⁷ 농도로 희석한 시료에서 1~2개의 colony가 관찰되었습니다. 이를 본 제품에 적용하였을 때 직접법에서 확인한 최대 1/10⁷ 농도까지 Target signal이 검출되는 것을 확인하였습니다. 이를 통해 본 제품을 활용한 부정시험이 직접법을 효과적으로 대체 할 수 있음을 확인하였습니다.