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LiliF 진단키트

Animal MDx

LiliF 진단키트 MDx Animal MDx

LiliF® AIV 5/7/9 Multi qRT-PCR Kit [의료기기 품목허가]

	Cat.No	용량	주문수량	판매가
	IP15007	96 tests	up down	별도문의

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제품정보
TroubleShooting Guide
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PRODUCT INFORMATION

Background Information

조류인플루엔자(Avian Influenza, AI)는 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생하는 급성 전염병으로, 닭·칠면조·오리 등 가금류에서 그 피해가 심하게 나타납니다. 고병원성인 H5 및 H7 혈청형은 세계동물보건기구(WOAH, 구 OIE)가 관리대상 질병으로 지정하여 발생 시 의무적으로 보고하도록 하고 있으며, 저병원성인 H9 혈청형 역시 높은 감염률과 지역적 유행 가능성으로 인해 주요 관리대상 혈청형으로 분류되고 있습니다. 조류인플루엔자 바이러스(AIV)는 표면항원인 혈구응집소(hemagglutinin, HA) 유전자에 따라 혈청형이 구분되므로, 신속한 방역 조치를 위해서는 HA 유전자 기반의 정확한 혈청형 감별이 중요합니다. 당사는 농림축산검역본부와의 실시간 유전자검사법 표준화 과제를 통해 AIV M, H5, H7 Real-time RT-PCR Kit를 상용화하였습니다. 본 제품은 H5, H7, H9 혈청형의 HA 유전자에 특이적인 프라이머/프로브를 적용하여 3종 혈청형을 하나의 튜브에서 동시에 감별할 수 있는 Multiplex Real-time RT-PCR 제품입니다. 기존 LiliF® AIV H5, H7 Real-time RT-PCR Kit와 동등한 민감도와 특이도를 유지하면서 검사 소요 시간을 약 2시간 10분에서 1시간 이내로 단축하였으며, LiliF® AIV M Real-time RT-PCR Kit (Fast ver.)와 동일한 PCR 조건으로 한 번의 running에서 함께 검사할 수 있습니다. 시약을 하나로 혼합한 PreMix를 자동 분주하여 공급함으로써 교차오염 우려를 줄였습니다.

Principle

• LiliF® AIV 5/7/9 Multi qRT-PCR Kit는 Multiplex Real-time RT-PCR을 이용한 RNA amplification technology 제품입니다.

• 본 제품은 Real-time RT-PCR을 위한 모든 구성요소가 튜브별로 분주된 PreMix 형태로, 시료로부터 추출한 RNA 5 µl를 첨가하여 즉시 검사 수행이 가능합니다.

• 하나의 튜브에서 H5(FAM), H7(Cy5), H9(TexasRed) 3종 혈청형을 동시에 검출할 수 있습니다.

• 반응의 검증을 위한 Positive Control과 내부 대조(IPC)를 포함하고 있어 시험의 유효성을 검증할 수 있습니다.

Intended Use

• 동물용의료기기 품목허가 제 133-35호 - 인수공통전염병 유전검사용 시약.

• 본 제품은 닭 및 오리의 인후두 swab, 총배설강 swab, 분변시료 및 조직 유제액 검체로부터 H5, H7 및 H9 아형 조류인플루엔자 바이러스의 혈구응집소(HA) 유전자를 검출하기 위해 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(Real-time RT-PCR, Reverse transcription-polymerase chain reaction)으로 정성 검출하는 시약입니다.

본 제품은 동물질병에 대한 병성감정에 필요한 시약으로 일반인 사용을 제한하는 전문가용 제품입니다.

Kit Contents

번호	Components	96 Tests / Kit
1	AIV 5/7/9 Multi qRT-PCR Kit	96 tests
2	Positive Control	25 μl x 3 tubes
3	DNase/RNase Free Water	1 ml x 1 tube
4	Manual	1ea

제품 성능 I Technical Data

H5 · H7 · H9 한 번에, 간섭 없는 동시 검출과 60분 이내 결과 확인

3개 아형 동시 검출 H5 · H7 · H9

60분 이내 PCR 반응 시간 (기존 약 130분)

100% 임상 민감도 · 특이도 (550건)

01. 검체 및 아형별 검출 성능

닭과 오리의 인후두 swab, 총배설강 swab, 분변 등 서로 다른 임상 검체에서 일관되게 표적 유전자를 검출하였습니다. 또한 아형별 농도를 다르게 조합한 조건에서도 검출한계 부근의 낮은 농도까지 안정적으로 검출되었으며, H5 · H7 · H9 채널 간 간섭 반응 없이 각 아형을 구분할 수 있음을 확인하였습니다.

a) H5 저농도, H7 고농도, H9 고농도 | b) H5 고농도, H7 저농도, H9 고농도
c) H5 고농도, H7 고농도, H9 저농도 | d) H5 저농도, H7 저농도, H9 저농도

02. 검사 시간 단축

자사 기존 제품인 LiliF® AIV H5 Real-time RT-PCR Kit, LiliF® AIV H7 Real-time RT-PCR Kit 대비 PCR 반응 시간을 약 130분에서 60분 이내로, 2배 이상 단축하였습니다. 민감도와 특이도는 기존 제품과 동등한 수준을 유지하여, 정확도는 그대로 지키면서 세 가지 아형의 결과를 더 빠르게 확인할 수 있습니다.

03. 임상 성능 평가

총 550건의 임상 검체(양성 330건: H5 110건, H7 110건, H9 110건 / 음성 220건)로 평가하였습니다. 자사 기허가 제품 2종(LiliF® AIV H5, LiliF® AIV H7 Real-time RT-PCR Kit) 및 H9 Reference Method¹⁾와 비교한 결과, 모든 검체에서 판정이 일치하여 아형별 임상적 민감도 100%, 임상적 특이도 100%를 확인하였습니다.

아형	비교 검사법	임상적 민감도 (1차 평가변수)	임상적 특이도 (1차 평가변수)
H5	LiliF® AIV H5 Real-time RT-PCR Kit	100% (110/110) 95% CI: 96.70–100%	100% (440/440) 95% CI: 99.16–100%
H7	LiliF® AIV H7 Real-time RT-PCR Kit	100% (110/110) 95% CI: 96.70–100%	100% (440/440) 95% CI: 99.16–100%
H9	H9 Reference Method¹⁾	100% (110/110) 95% CI: 96.70–100%	100% (440/440) 95% CI: 99.16–100%
대조시험과의 일치도 (2차 평가변수)		100% (550/550) 95% CI: 99.33–100%

Result			Reference
			LiliF® AIV H5 Real-time RT-PCR Kit		LiliF® AIV H7 Real-time RT-PCR Kit		H9 Reference Method¹⁾
			양성	음성	양성	음성	양성	음성
LiliF® AIV 5/7/9 Multi qRT-PCR Kit	H5	양성	110	0	-	-	-	-
	H5	음성	0	440	-	-	-	-
	H7	양성	-	-	110	0	-	-
	H7	음성	-	-	0	440	-	-
	H9	양성	-	-	-	-	110	0
	H9	음성	-	-	-	-	0	440

TroubleShooting Guide

Q양성 대조군(Positive Control, PC)이 예상대로 증폭되지 않는 경우 어떻게 해야 하나요?: APositive Control이 올바르게 첨가되었는지, 정해진 반응 용량과 qRT-PCR 반응 조건을 따랐는지 확인합니다. AIV 5/7/9 Multi qRT-PCR PreMix는 사용 전에 완전히 녹인 후 짧게 원심분리했는지 확인해 주십시오. 키트가 −20°C 이하에서 보관되었는지, 유효기간이나 개봉 후 권장 사용 기간이 지나지 않았는지도 확인합니다. 그래도 Positive Control이 계속 증폭되지 않으면 새 키트 구성품으로 재시험하고 장비 설정을 확인해 주십시오.

Q음성 대조군(Negative Control, NC)에서 증폭이 나타나는 이유는 무엇인가요?: ANegative Control에서 증폭이 나타나면 반응 과정에서 오염이 발생했을 가능성이 있습니다. Negative Control로는 키트에 포함된 DNase/RNase-free water를 사용하고, Positive Control 및 검체와 분리하여 다루어 주십시오. 반응 준비는 깨끗한 작업 공간에서 하고, 필터 팁을 사용하며, 튜브 간 교차 오염에 주의합니다. 작업 공간을 오염 제거한 후 새 시약으로 재시험해 주십시오. 오염이 의심되는 시험의 결과는 원인을 해결하기 전까지 판독하지 않습니다.

Q내부 양성 대조(IPC, HEX)가 검출되지 않으면 어떤 의미인가요?: AIPC는 검체 종류와 관계없이 사용되는 외인성(exogenous) DNA 대조입니다. 표적 신호가 강하지 않은 검체에서 IPC 신호가 나타나지 않으면 검사 과정의 문제나 PCR 저해 가능성을 의미할 수 있습니다. 재시험 전에 핵산 추출 과정, 검체 상태, 시약 취급, 반응 구성을 확인해 주십시오. 단, 강양성 검체에서 IPC가 검출되지 않는 경우에는 제품 사용설명서에 따라 양성 판정에 영향을 주지 않습니다.

Q검체에서 H5, H7, H9 모두 증폭이 나타나지 않는 이유는 무엇인가요?: A검체가 적절하게 채취 · 보관되었는지, 핵산 추출이 추출 키트 제조사의 사용법에 따라 진행되었는지 확인합니다. 추출 직후 바로 검사하는 것을 권장합니다. 형광 채널과 반응 조건이 올바르게 설정되었는지 확인해 주십시오. 특히 증폭 단계에서 60°C, 15초에 형광 신호를 측정하도록 설정되어 있는지 점검합니다. PCR 저해 물질이나 표적 부위의 염기서열 변이로 인해 위음성 결과가 나올 수 있습니다. 검체를 음성으로 판정하기 전에 IPC와 대조군 결과를 반드시 확인해 주십시오.

QCut-off 값 부근의 결과는 어떻게 해석하나요?: ACFX96 장비 기준으로 설정된 표적별 Cut-off 값에 따라 판정합니다.
- H5 (FAM): Ct 38 이하
- H7 (Cy5): Ct 35 이하
- H9 (Texas Red): Ct 36 이하
해당 Cut-off 값을 초과하거나 Ct 값이 없으면 제품 사용설명서에 따라 음성으로 판정합니다. Baseline과 Threshold가 Auto로 설정되어 있는지, 각 표적에 올바른 형광 채널이 지정되었는지 확인해 주십시오. 결과가 다른 소견과 일치하지 않으면 대조군 결과를 검토하고, 실험실 절차에 따라 재시험을 고려합니다.

Q시험이나 장비마다 Ct 값이 달라지는 이유는 무엇인가요?: A검체 취급, 핵산 추출, 분주, 시약 보관, 장비 설정의 차이에 따라 결과가 달라질 수 있습니다. 각 반응에는 AIV 5/7/9 Multi qRT-PCR PreMix 20 µL와 검체 RNA, Positive Control 또는 Negative Control 5 µL가 들어가야 합니다. 잘 섞은 후 짧게 원심분리하여 기포를 제거하고 반응액을 튜브 바닥에 모아 주십시오. 장비 설정을 일정하게 유지하고, 반복적인 동결 · 해동은 피해 주십시오. 표시되는 Ct 값은 사전 증폭 5 cycle을 제외한 값으로, 정성 판정용이며 정량 분석에는 사용할 수 없습니다.

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